動物組織中鹽酸克侖特羅等4種β-激動劑藥物殘留檢測（Cleanert PCX, P/N: CX1506）

1.實驗材料

1.1 固相萃取小柱：PCX(150mg/6mL)

1.2 四種β-激動劑藥物：鹽酸克侖特羅、沙丁胺醇、西馬特羅、萊克多巴胺等4種β-激動劑藥物。

2. 試料的制備

取空白樣品，經(jīng)過液液萃取初步處理后，添加適宜濃度的標準溶液作為空白添加試料。

3. 凈化

   依次用甲醇5mL、水5mL和30mmol/L鹽酸5mL潤洗固相萃取小柱，將上述備用液過柱，依次用水5mL、甲醇5mL淋洗，真空抽干，用4%氨化甲醇5mL洗脫PCX小柱，收集洗脫液于具塞玻璃試管中，50℃下氮氣吹干。在樣液過柱和洗脫過程中流速控制在1mL/min左右。

4. 衍生化及檢測

將上述盛有殘渣的具塞玻璃試管放入50℃烘箱中加熱片刻，除去水分后，加入甲苯100mL和雙*基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）100mL，渦旋振蕩20s，密封玻璃塞，置于80℃恒溫烘箱中加熱l小時，冷卻后加入300mL甲苯，作為試樣溶液，供氣相色譜-質譜分析。

5. 結果

5.1 回收率實驗（精密度和準確度）

將豬肝空白樣品經(jīng)過液液萃取初步處理后，分別添加一定量的標準溶液，配制1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L和100μg/L五個濃度的試樣溶液，每批次內(nèi)同一濃度做5次平行實驗，共4個批次（樣品典型回收率色譜圖見附圖）。

豬肝中實驗結果列表如下

5.2重復性實驗（批間誤差實驗）：

豬肝中實驗結果列表如下

附圖：豬肝中0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L和100μg/L六個濃度檢測結果總離子流圖（TIC）代表圖譜：

liver+1ppb(pcx)

豬肉中五種磺胺藥物的檢測（Cleanert SUL-5, P/N: SUL-5）

一、實驗材料

1．SPE柱：Cleanert SUL-5（2g/10mL）

2．五種磺胺類藥物：磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺甲唑(SMZ) 、 磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺喹啉(SQ)

3．標準樣品工作液

標準樣品根據(jù)NY 5029-2001附錄E配制，濃度為10mg/kg。

二、實驗過程

1.柱保留回收率實驗方法

按照NY 5029-2001附錄E中的方法進行柱保留實驗。具體步驟為：吸取50µL或100µL混合標準工作液于2.95mL或2.90mL95%乙腈中溶解，然后過已經(jīng)5mL95%乙腈活化的SUL-5小柱。具體步驟如下：

1）柱平衡：95%乙腈5mL

2）上樣（95%乙腈樣品溶液 3mL）

3）預淋洗：5mL95%乙腈淋洗

4）洗脫：70%乙腈10mL洗脫

收集洗脫液，進行HPLC分析，進樣量為20µL。

2.添加回收率實驗

按照NY 5029-2001附錄E中的方法進行添加回收率實驗。具體步驟為：稱取組織樣品5g（到0.01g）于已加有10g無水*的離心管中，然后加入乙腈25mL，,以10000r/min以上的速度均質1min后，以3000r/min的速度離心5min。分離后的殘渣再用25mL乙腈處理，以3000r/min的速度離心5 min。合并兩次的上清液，加入用正己烷30mL，振蕩10min，以3000r/min的速度離心5min，取下層液體，加正丙醇10mL，50℃下減壓干燥至干，殘留物用95%乙腈3mL溶解，過堿性氧化鋁小柱。用95%乙腈5mL過柱，不收集，再用70%乙腈10mL洗脫后，收集洗脫液進行液相色譜儀測定。

3．實驗結果與分析

3．1 柱保留回收率實驗

對Cleanert SUL-5小柱分別進行了兩種濃度的柱保留回收率實驗，濃度設置相當于實際樣品中含有100µg/kg和200µg/kg磺胺類藥物，實驗結果見表1、表2，從表中可見Cleanert小柱SM₂、SMM、SMZ、SDM和SQ的平均回收率范圍分別為92.47~99.37%、93.69~99.44%、88.61~96.27%、90.87~96.06%和91.83~95.92%，效果良好；同樣從表中可見Cleanert小柱的批內(nèi)變異系數(shù)在0.30~9.38%之間，小柱的穩(wěn)定性較好。

3．2 樣品回收率實驗

對Cleanert SUL-5小柱進行了兩個濃度的回收率實驗，每個濃度6個重復，結果見表3。從表3可知Cleanert小柱在100µg/kg和200µg/kg添加濃度下，豬肉中的平均回收率在80.62~94.49%范圍內(nèi)，批內(nèi)變異系數(shù)在3.98~7.79%范圍內(nèi)，回收率高，穩(wěn)定性好。

表1. Cleanert小柱保留回收率實驗結果(濃度相當于組織中100µg/kg)

表2. Cleanert小柱保留回收率實驗結果(濃度相當于組織中200µg/kg)

              表3. Cleanert小柱豬肉樣品回收率實驗結果

水產(chǎn)品、進口肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素含量檢測方法（Cleanert PS, P/N: PS2003）

1．SPE柱：Cleanert PS柱（200mg/3mL）

2．樣品處理

稱取5g經(jīng)勻漿處理的樣品于100mL離心管內(nèi)，分別加入含有EDTA₂Na的檸檬酸緩沖液30mL、20mL，混合震蕩提取，合并上清液。加入20mL正己烷和上清液于分液漏斗中，充分混合震蕩5min，合并下層。

含有EDTA₂Na檸檬酸緩沖液的配制：取0.1mol/L檸檬酸緩沖溶液307mL和0.5mol/L磷酸氫二鈉緩沖溶液193mL混合均勻，向其中加入1.86gEDTA₂Na，溶解后作為樣品提取液。

3．凈化步驟：

以10mL甲醇，10mL水，5mL EDTA₂Na活化PS柱，加入上清液，然后以10mL水淋洗小柱，抽干，zui后以10mL甲醇洗脫目標物，并收集。

4．濃縮及定容：

濃縮：在旋轉蒸發(fā)儀上減壓濃縮，溫度小于40℃

定容：加入1.0mL的1.36%的磷酸二氫鉀溶液，將定容液進行HPLC分析

5．HPLC條件

色譜柱：Venusil MP C18, 5µm,4.6*250mm

流動相：A:B=77:23

A：咪唑緩沖液—稱取68.08咪，10.72乙酸鎂，0.37EDTA₂Na 溶于800mL水中，用冰乙酸調pH到7.2，加水定容到1000mL.

B：乙腈

6．結果：（兩個平行）

蜂蜜中四環(huán)素檢測（Cleanert PEP,Cleanert COOH,P/N：PE5006,CH5003）

1. 樣品制備：稱6g蜂蜜樣品+30mL提取液（PH=4.0），旋渦振蕩

提取液配制：檸檬酸10.5g+磷酸氫二鈉（無水）8.88g+乙二胺四乙酸鈉30.3g+820mL水，用2M HCl調PH至4.0）

2．SPE步驟

① PEP(500mg/6mL)

   活化：甲醇，水

   上樣：把樣品提取液過柱

   淋洗：5%甲醇/水 5mL,抽干

②COOH(500mg/3mL)

  活化：乙酸乙酯，2柱管

③PEP（上）-COOH（下） 串聯(lián)

 淋洗： 15mL乙酸乙酯淋洗，拿下PEP柱，COOH柱抽干（5min）

 洗脫： 流動相（0.01M草酸：乙腈：甲醇=350：100：50）4.5mL

 定容： 洗脫液用0.01M草酸定容至5mL,搖勻，過濾膜，UPLC測定。

硝基呋喃類代謝物殘留量的LC/MS測定方法 (Cleanert PEP，P/N:PE0603)

1．材料：SPE柱：PEP(60mg/3mL)

2．樣品制備

2．1 奶粉和牛奶樣品處理

2.1.1 樣品處理：奶粉1g(牛奶稱5g)，加15 mL三氯乙酸-水混合溶液（2+1，5mol）,加內(nèi)標，加混標，37.5℃水浴水解5小時，取出后4000 rpm離心5min，取上清液待用。

2.1.2  樣品初步凈化及衍生：PEP柱以5mL甲醇，5mL水活化，后把2.1.1處理好的上清液過柱，待樣液全部通過固相萃取柱后用5ml的三氯乙酸淋洗全部收集到另一個管中，加100μl衍生劑(20mg而硝基苯甲醛溶于1ml二甲亞砜)，放入37.5℃水浴中衍生16小時（過夜）。

2．2 豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品和蜂蜜樣品處理

2.2.1樣品粗處理：豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品稱2g（蜂蜜稱5g），加入15mL甲醇-水混合溶液（2+1），渦旋，混勻， 4000 rpm離心5min，吸取上清液，加入內(nèi)標及混標。

2.2.2 衍生：在上述上清液中加100μL衍生劑(20mg而硝基苯甲醛溶于1mL二甲亞砜)，放入37.5℃水浴中衍生16小時（過夜）。加磷酸氫二鉀緩沖液5mL（pH約為7.4），4000 rpm離心10 min，（若待測樣品含脂肪較多，上清液加5 mL正己烷，振蕩2 min，4000 rpm離心10 min吸取并棄掉正己烷）

3．PEP柱凈化

1) 活化：PEP柱以5mL甲醇，5mL水活化

2) 上樣：將2.2.1或2.2.2中的衍生液加磷酸氫二鉀緩沖液5ml，用1mol/l*溶液調節(jié)溶液pH約為7.4，4000 r/min離心10 min，上清液（若待測樣品含脂肪較多，上清液加5 mL正己烷，振蕩2 min，4000 r/min離心10 min吸取并棄掉正己烷）以小于2 mL/min的流速通過PEP柱

3) 淋洗：以10 mL水洗滌固相萃取柱，棄去全部流出液。用真空泵在65 kPa負壓下抽干PEP固相萃取柱15 min。

4) 洗脫：用5 mL乙酸乙酯洗脫被測物于25 mL棕色離心管中。

5) 濃縮：洗脫液在40℃水浴中氮氣吹干，用樣品定容液溶解并定容至1.0 mL，混勻后過0.2μm濾膜用液相色譜-串聯(lián)質譜測定。

動物性食品中糖皮質激素類藥物多殘留LC/MS檢測方法 (Cleanert Silica, P/N:SI5006)

1．固相萃取柱：Cleanert Silica，500mg/6ml

2．提取

2.1肌肉組織樣品

稱取組織試料5g（±0.05g）于50mL離心管中，加30mL乙酸乙酯, 10g無水*，均質1min，200r/min搖床振動20 min，4200r/min離心10min,移取乙酸乙酯層。殘渣中加乙酸乙酯25mL, 均質1min，200r/min搖床振動20 min，4200r/min離心10min,移取乙酸乙酯層。合并兩次提取液，40℃旋轉至近干，加乙酸乙酯1mL和正已烷5mL,溶解殘渣,待凈化。

 2.2 牛奶、雞蛋樣品

稱取牛奶或雞蛋試料5g（±0.05g）于50mL離心管中，加30mL乙酸乙酯,均質1min，200r/min搖床振動20 min，4200r/min離心10min,移取乙酸乙酯層。殘渣中加乙酸乙酯25mL，均質1min，200r/min搖床振動20 min，4200r/min離心10min，移取乙酸乙酯層。合并兩次提取液，40℃旋轉至近干，加乙酸乙酯1mL和正已烷5mL,溶解殘渣,待凈化。

3．凈化

   用正已烷6mL活化Silica柱，提取液過柱。用正已烷6mL淋洗萃取柱，抽干，用正已烷-丙酮(6/4,V/V)6mL洗脫。洗脫液50℃氮氣吹干，加20%乙腈水溶液0.5mL,溶解殘渣，轉入1.5mL離心管中，4200r/min離心20min，取上清液，過0.22um濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質譜法測定。

動物源食品中玉米赤霉醇類藥物殘留LC/MS檢測 (Cleanert NH2, PAX, P/N:NH5006, AX1506)

1.SPE柱：Cleanert NH2:500mg/6mL, PAX: 150mg/6mL

2.樣品處理

2.1肌肉組織樣品

 2.1.1 提取：稱取5g（±0.05g）于50mL離心管中，加甲醇15mL,渦旋1min,4000r/min離心10min,取上清液于另一離心管中。重復提取一次，合并兩次提取液。加正已烷20mL,手搖20次，3000r/min離心5min,棄上層正已烷。再加正已烷20mL重復脫脂一次。下層轉至100mL雞心瓶中，50℃旋蒸至近干，加乙酸乙酯5mL,渦動1min,靜置10s,上清液轉移至同一個離心管。再用正已烷10mL洗滌雞心瓶一次，合并三次殘余物溶解液，備用。

2.1.2凈化：氨基柱上加無水*2g，用玻璃棒敲勻。依次用乙酸乙酯和正已烷各5mL活化，取備用液全部過柱，再依次用正已烷、正已烷-乙酸乙酯(60+40,v/v)各5mL淋洗。依次用正已烷-乙酸乙酯（20+80，V/V）和乙酸乙酯各4mL洗脫，合并兩次洗脫液，50℃氮氣吹干。

2.1.3凈化：殘余物中加乙腈0.5mL,渦動1min，加水0.5mL,混勻，過0.2um有機濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。

2.2 肝臟組織樣品

2.2.1 稱取5g（±0.05g）于50mL離心管中，加甲醇10mL,渦旋1min,4000r/min離心5min,取上清液于另一離心管中。重復提取一次，合并兩次提取液。加正已烷10mL,手搖20次，3000r/min離心5min,棄上層正已烷。下層于50℃氮氣吹干，加乙酸乙酯5mL,渦動1min,再加正已烷20mL渦動30s, 4000r/min離心5min,取上清液備用。

2.2.2 凈化：氨基柱上加無水*2g，用玻璃棒敲勻。依次用乙酸乙酯和正已烷各5mL活化，取備用液全部過柱，再依次用正已烷、正已烷-乙酸乙酯(45+55,v/v)各5mL淋洗。依次用正已烷-乙酸乙酯（20+80，V/V）和2%甲醇乙酸乙酯各5mL洗脫，合并兩次洗脫液，50℃氮氣吹干。

2.2.3凈化：殘余物中加乙腈0.5mL,渦動1min，加水0.5mL,混勻，加正已烷2mL,渦動30s,9000r/min離心5min,取下層清液，過0.2um有機濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。

2.3 牛奶樣品

2.3.1 提取：量取5.0mL試料于50mL離心管中，加18%的硫酸溶液0.1mL,渦勻，靜置10min,加正已烷10mL和乙腈20mL，300r/min振蕩10min，4000r/min離心10min，棄正已烷層。取提取液12.5mL于離心管中，50℃氮吹至小于0.1mL。加水10mL,用5mol/lNaOH調節(jié)Ph值至11，9000r/min離心5min,備用。

2.3.3 凈化：Cleanert PAX固相萃取柱依次用甲醇、水各2mL活化和平衡，將備用液過柱，依次用甲醇-氨水-水（5+5+90,V/V/V）1mL和甲醇0.5mL洗滌，用2%乙酸乙腈4mL洗脫，收集洗脫液，50℃下氮氣吹干。

2.3.3凈化：殘余物中加乙腈0.5mL,渦動1min，加水0.5mL,混勻，過0.2µm有機濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。

2.4 雞蛋樣品

2.4.1提取：稱取5g（±0.05g）于50mL離心管中，加乙腈10mL,渦動1min,9000r/min離心5min，取上清液于另一立新觀眾。重復提取一次，合并兩次提取液。取12.5mL于離心管中，50℃氮吹至小于0.1mL。加水10mL,用5mol/lNaOH調節(jié)Ph值至11，9000r/min離心5min，備用。

2.4.2凈化：Cleanert PAX固相萃取柱依次用甲醇、水各2mL活化和平衡，將備用液過柱，依次用甲醇-氨水-水（5+5+90,V/V/V）1mL和甲醇0.5mL洗滌，用2%乙酸乙腈4mL洗脫，收集洗脫液，50℃下氮氣吹干。

2.2.3凈化：殘余物中加乙腈0.5mL，渦動1min，加水0.5mL,混勻，過0.2µm有機濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。